伤口愈合受损仍然是一个全球性挑战，其导致皮肤疤痕或受伤后或手术后愈合失败。生物材料伤口敷料提供了一个有前景的解决方案，通过调节宿主免疫和基质细胞活动来增强愈合。巨噬细胞（Mϕ）是早期炎症和后期修复阶段的关键调节因子，清除受损组织，解决炎症，并促进修复。适当且及时的激活对于防止慢性伤口或由于过度炎症或修复引起的纤维化至关重要。成纤维细胞收缩伤口并沉积新的细胞外基质（ECM）以形成富含胶原的疤痕。生物材料敷料与伤口中的宿主细胞相互作用，改变它们的环境，可以用来操纵愈合。一些研究表明，生物材料可以通过免疫细胞机制促进皮肤再生。了解生物材料属性如何调节细胞功能对于设计支持修复同时减少疤痕的伤口敷料至关重要。

来自美国加利福尼亚大学尔湾分校的Wendy F. Liu团队探究了明胶基水凝胶的交联如何影响免疫和基质细胞行为以及雌性小鼠的伤口愈合。上海医疗器械展会Medtec观察到，较软、轻度交联的水凝胶促进了更多的细胞浸润，并且与较硬、重度交联的水凝胶相比，形成的疤痕更小。通过单细胞RNA测序，进一步展示了重度交联的水凝胶增加了炎症，并导致形成了一个独特的巨噬细胞亚群，表现出氧化活动和细胞融合的迹象。相反，轻度交联的水凝胶更容易被巨噬细胞摄取并整合到组织中。物理性质差异性地影响巨噬细胞和成纤维细胞的相互作用，重度交联的水凝胶促进促纤维化成纤维细胞活性，通过RANKL信号传导驱动巨噬细胞融合。这些发现表明，调节水凝胶的物理性质可以指导细胞反应并改善愈合，为设计更好的伤口治疗生物材料提供了见解。相关工作以题为“Hydrogel crosslinking modulates macrophages, fibroblasts, and their communication, during wound healing”的文章发表在2024年08月09日的期刊《Nature Communications》。

1.创新型研究内容

本文使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）来研究不同明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）交联度对伤口细胞行为的影响。本文将软质、轻度交联的GelMA（lo-GelMA，3 kPa）与硬质、高度交联的GelMA（hi-GelMA，150 kPa）应用于全层小鼠皮肤伤口。组织学和scRNA-seq分析揭示了不同的细胞反应：hi-GelMA诱导了增强的炎症和类似异物的反应，而lo-GelMA促进了细胞整合和生物材料的吞噬清除。在hi-GelMA条件下，Mϕ表型偏向于促炎激活，靠近水凝胶的一个亚群产生了高氧化环境。hi-GelMA伴随的增强炎症表现为促纤维化成纤维细胞活性升高。对伤口转录组的细胞-细胞通信网络分析确定了Mϕ-成纤维细胞双向信号的差异，与lo-GelMA相比，hi-GelMA向促炎和促纤维化激活的转变。这些发现表明水凝胶交联与细胞-材料相互作用之间存在关键联系，强调了在伤口愈合的生物材料设计中理解这些动态的重要性。

【GelMA交联影响疤痕大小和组织结构】

为评估GelMA交联对疤痕和伤口结构的影响，本文将GelMA应用于5毫米全层背部皮肤伤口。使用365纳米光照1分钟创建轻度交联的水凝胶（lo-GelMA），使用5分钟光照创建重度交联的水凝胶（hi-GelMA）。所有伤口用Tegaderm覆盖，对照伤口（Sham）未处理，仅用Tegaderm覆盖（图1a）。在伤后第5、10和30天收集伤口组织进行组织学检查。在PWD30时，与Sham相比，lo-和hi-GelMA都倾向于产生更小的疤痕尺寸；然而，lo-GelMA在疤痕面积上显示出显著减少（图1b）。在PWD5和10时对伤口进行H&E染色显示，在PWD5时，lo-GelMA具有各种大小的细胞浸润通道，与真皮整合良好，随着纤维组织细胞、内皮细胞和其他免疫细胞从伤口边缘和深处浸润到支架中（图1c）。相比之下，hi-GelMA显示出最小的细胞浸润和由于更强的异物反应（FBR）引起的生物材料排出的开始。此外，在PWD5时，lo-GelMA上的再上皮化覆盖了60-100%的伤口，而hi-GelMA仅覆盖了2-5%（图1c），这与之前关于多孔支架的研究一致。在hi-GelMA外围的聚集体表明生物相容性差，可能是由于不利的hi-GelMA-周围伤口相互作用。lo-GelMA的横截面积范围为1–5 mm²，而hi-GelMA的测量值为4–7 mm²（图1c），表明lo-GelMA降解更多。到了PWD10，lo-GelMA的横截面积为0–1 mm²，而hi-GelMA仍未结合，导致在凝胶下再上皮化并最终排出。总的来说，lo-和hi-GelMA的反应在生物相容性和细胞整合方面似乎有所不同，因此本文假设水凝胶及其交联程度通过调节免疫和基质细胞来调控疤痕形成。    

图1  GelMA水凝胶敷料的交联调节了全层小鼠皮肤伤口的疤痕形成、愈合动态和细胞浸润

【GelMA交联调节早期伤口成分】

本文使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）来研究GelMA在伤后第5天（PWD5）对伤口成分的影响（图1a）。每个处理组五只小鼠的伤口组织被汇集，酶解离，并使用10X Chromium V3.1进行处理以制备RNA库。在NovaSeq上进行测序，每个样本产生大约10,000个细胞，每个细胞的读取深度为50,000次。Cell Ranger用于数据比对，分析在Seurat中进行。经过质量控制后，样本包含：Sham对照组5400个细胞，lo-GelMA组6579个细胞，hi-GelMA组5007个细胞。Louvain聚类揭示了九个不同的细胞群集，通过UMAP可视化（图1d），并通过差异基因签名和规范标志物确定了群集身份（图1e）。成纤维细胞和巨噬细胞（Mϕs）主导了伤口种群（图1f, g）。成纤维细胞平均占细胞总数的57.2%，其中lo-GelMA的比例最高（66.1%），相较于hi-GelMA（50.1%）和Sham（55.3%）（图1f, g）。Mϕs平均占总细胞数的20.9%，在Sham中最高（25.1%），在hi-GelMA（20.2%）和lo-GelMA（17.5%）中较低。中性粒细胞平均占14.5%，几乎在hi-GelMA（22.5%）中翻倍，相较于lo-GelMA（9.5%）和Sham（11.6%），这表明在hi-GelMA中炎症升高。    

上海医疗器械展会Medtec现场将举办第七届医疗器械设计论坛等多个与设计相关的论坛，本次会议将围绕医疗器械产品的设计理念和设计方式，结合具体的案例分享展开，为医疗器械研发人员提供经验借鉴和行业分享。点击此处立刻预登记>>>

【GelMA交联调节了巨噬细胞亚群】

为探索交联效应对巨噬细胞（Mϕ）免疫调节的影响，本文通过将Cd68^high/Mrc1^high群体细分为六个功能亚群（M1-6），基于与规范标志物相比的差异基因签名（图2a）和基因本体论（GO）表征（图2b-d）进行了分析。比较hi-和lo-GelMA，亚群M1和M4在hi-GelMA中上调，而M5和部分M3在lo-GelMA中上调。M2和M6在很大程度上不受GelMA交联的影响，但在两种GelMA条件下与Sham相比，M6都有所减少。

被hi-GelMA上调的集群——M1和M4——显示出促炎特征，其中M4还表现出明显的氧化特征。M1在lo-GelMA中占Mϕs的18.1%，在Sham中占17.1%，但在hi-GelMA中上升到24.5%（图2b）。这个集群包括单核细胞标志物Ly6c和Ccr2以及早期炎症标志物Il1b、Ccl3和Ptgs2（图2c）。GO分析显示了细胞因子活性以及整合素和胶原结合，表明炎症活动与细胞外基质的细胞外渗或粘附相耦合（图2d）。差异表达分析显示，与lo-GelMA相比，hi-GelMA中的M1在早期炎症基因如警报素（S100a8、S100a9）方面更为活跃。同样，与Sham相比，hi-GelMA中的M1（而非lo-GelMA）在抗菌防御基因（S100a8、S100a9、S100a11、Ly6c、Ifitm1和Chil3）方面有所增加。M4表现出促炎特征，伴有升高的Il1b、分解代谢活性（Mmp12）和氧化活性（Hvcn1）（图2c）。GO分析也显示了高氧化活性（图2d）。M4的存在在hi-GelMA中几乎翻倍（13.3%），与lo-GelMA（6.8%）和Sham（6.5%）相比（图2b），这表明水凝胶交联显著调节M4水平。值得注意的是，中性粒细胞在hi-GelMA中富集（图1f, g），且增加了与中性粒细胞外渗、激活和小颗粒释放相关的炎症基因和GO术语的表达。这些数据一起表明，与lo-GelMA或Sham相比，hi-GelMA诱导了更多的炎症。   

图2  GelMA水凝胶敷料的交联调节了巨噬细胞的功能

【高交联GelMA增强了巨噬细胞的氧化应激和糖酵解】

M4相关的基因和GO术语显示了促炎、分解代谢和氧化活性，这个集群在hi-GelMA中比lo-GelMA更为显著（图2b,d）。在这个群体中，本文观察到与氧化应激相关的M4表达基因——Cat、Cybb、Sod1、Hif1a和Ucp2——在hi-GelMA中比lo-GelMA更为突出（图3a）。升高的氧化可能导致持续的组织损伤和炎症解决的延迟，从而导致瘢痕增加。此外，M4 Mϕs表现出高表达关键的ECM蛋白酶，Mmp12和Mmp9，这也在hi-GelMA中比lo-GelMA更高（图3b）。本文假设这些Mϕs直接响应hi-GelMA并显著促进了增加的炎症和纤维化。    

图3 GelMA交联在伤口愈合过程中调节巨噬细胞

【GelMA交联对巨噬细胞吞噬作用的调节】

虽然M4显示出分解代谢活性，但GO分析显示，在lo-GelMA中富集的M3表现出吞噬活性（图2b-d）。在M3中，以及在较小程度上在M4中，与吞噬活性相关的基因（Lamp1、Rab7、Rab31、Trem2）在lo-GelMA中比在hi-GelMA中更为突出（图4a）。为了比较hi-和lo-GelMA的巨噬细胞吞噬作用，将标记的BMDM（CellTracker，绿色）接种在用pH敏感染料（pHrodo，红色）标记的水凝胶上。12小时后，BMDM显示出对lo-GelMA相比hi-GelMA有显著更高的吞噬作用（图4b）。为探索整合素如何影响Mϕ-GelMA相互作用，本文探究了与粘附和吞噬相关的整合素的表达谱。结果表明：与其他亚群相比，Itgal、Itgax、Itgb2和Itgav在M4中上调更多（图4c）。在体外在GelMA上接种BMDM 24小时显示，Itgal、Itgax、Itgb2、Itgav的表达增加，一定程度上还有Itga5（图4c）。这些整合素在lo-和hi-GelMA上的表达水平相似，除了Itgav在lo-GelMA上更高。    

图4 GelMA交联差异性调节巨噬细胞的吞噬作用

【GelMA交联调节成纤维细胞亚群】

接下来，本文研究了GelMA交联对伤口成纤维细胞表型的免疫调节作用。Col1a1^high/Cthrc1^high成纤维细胞被细分为六个不同的功能亚群，这些亚群在不同伤口处理中的比例各不相同（图5a, b）。功能表型与不同的基因特征、规范标志物和GO分析相关联（图5d, e）。亚群F1、F5和F6在hi-GelMA中比lo-GelMA更为普遍，而F2、F3和F4在lo-GelMA中相对于hi-GelMA有所增加（图5b）。

在hi-GelMA中，肌成纤维细胞集群（F1和F6）最为上调，表达了与收缩性伤口闭合和瘢痕形成相关的基因。F1平均占成纤维细胞的15.5%，在hi-GelMA（18.9%）和Sham（18.8%）中比lo-GelMA（11.8%）更为普遍。这个集群表达了Col12a1和Cxcl12，在一定程度上还有Acta2和Tagln，以及涉及ECM产生、肌成纤维细胞分化和细胞因子/趋化因子活性的GO通路（图5d, e）。F6还有更高的增殖标记物，包括Mki67和G2/M期基因。总的来说，F1和F6在hi-GelMA中占成纤维细胞的33%，在Sham中占31%，在lo-GelMA中占18%。最后，F5在hi-GelMA（11.4%）和Sham（12.4%）中比lo-GelMA（8.7%）更丰富。    

图5 GelMA水凝胶敷料的交联调节了伤口愈合中的成纤维细胞功能和胶原沉积

【GelMA交联调节巨噬细胞-成纤维细胞信号传导】

随着GelMA交联程度的增加，导致更多的炎症性Mϕs和纤维化成纤维细胞的出现，本文探究了在hi-与lo-GelMA处理的伤口中它们的相互作用。免疫荧光染色在第5天创伤后显示，Mϕs和成纤维细胞在整个伤口中紧密相邻。CellChat分析的配体-受体对揭示了来自M4的高度外向和内向信号，以及与lo-GelMA相比，hi-GelMA中M1的内向信号减少（图6a）。信息流分析，追踪细胞对之间的通信概率，显示hi-GelMA显著上调了促纤维化的血小板衍生生长因子（PDGF）、肿瘤抑制素M（OSM）和核因子kappa-Β配体活化受体（RANKL）通道（图6b）。相反，lo-GelMA主要特征为IL2、GAS和TENASCIN通道，这些通道参与了Mϕ表型调节。    

图6 在高交联与低交联GelMA处理的伤口中，Mϕs和成纤维细胞之间的细胞-细胞信号相互作用发生改变

图7 GelMA交联对伤口愈合影响的示意图

2.总结与展望

本文探究了不同的GelMA交联对伤口愈合的影响，揭示了几种相互作用机制（图7）。与未处理的伤口相比，GelMA敷料导致较小的疤痕，而且较软、较快降解的lo-GelMA与较小的疤痕、促愈合的细胞特征和坚硬、较慢降解的hi-GelMA减少的真皮胶原增厚相关联（图1和5）。上海医疗器械展会Medtec认为这些发现与之前研究生物材料硬度在伤口愈合中的作用一致。更硬、高度交联的材料如hi-GelMA引发更强的FBR，由于不利的细胞-材料相互作用，相比可降解材料增加炎症和纤维化。虽然本文使用Tegaderm覆盖伤口，但在未来研究中加入严格的机械控制，如伤口夹板，将允许更准确地评估生物材料交联对愈合动态的影响。本文还观察到宿主对lo-与hi-GelMA的不同反应，前者更好地整合到愈合的皮肤中，更快降解而不触发FBR，并改善了再上皮化、真皮增殖和减少疤痕（图1c）。lo-GelMA中增加的孔隙率可能促进了细胞浸润，有报告表明GelMA交联与孔隙率之间存在反比关系。相比之下，hi-GelMA显示出早期FBR迹象，阻碍了再上皮化，减少了细胞浸润，并从伤口床中被挤出。lo-GelMA和hi-GelMA之间的对比结果突出了生物材料特性在伤口愈合中的重要性，以及它们对免疫和基质细胞的调节作用。    

文章来源：https://doi.org/10.1038/s41467-024-50072-y