生物学检测方法研究生物活性物质之间相互作用及其影响，或者利用生物活性物质之间相互作用进行定量，是生命科学研究领域和药物研发过程中必不可少的工具。有别于色谱质谱拉曼光谱等仪器分析方法，生物学检测方法往往是间接的，其间接性导致方法可靠性，稳定性等相对于仪器分析方法较差。从整体宏观的角度了解生物学检测方法的间接性是建立一个稳定的生物学检测方法的关键因素之一。

如下图所示，仪器分析方法(a)研究的是样品本身直接相关的特性，如样品的分子量大小，样品的电荷等；与此相对，生物学检测方法（b）首先要存在或者建立一个Test system，然后加入样品反应，检测样品引起Test system的变化，其检测和样品本身是间接相关，检测目标分子实体不是样品本身，这是其检测目标的间接性。如某药物对肿瘤细胞的杀伤实验，Test system为细胞，引起的变化是细胞的死亡，检测目标分子实体为代表活细胞的ATP浓度或者代表死细胞的LDH浓度。 

大多数生物学检测方法存在一个复杂的Test system，样品引起Test system的变化也需要在温和的条件下进行，这使得目标分子很难进行有效的分离并采用仪器分析方法进行检测，需要引入荧光标记抗体，酶标抗体，或酶催化底物等和目标分子进行反应转换成信号值，建立信号值和目标分子的间接联系，这是检测信号传递的间接性。如下图所示，在一个ELISA直接法的实验中，样品是抗体，检测体系是抗原，引起的变化目标分子抗体-抗原偶联物，而信号值代表的是TMB催化产物，TMB催化产物经过酶标抗体和目标分子抗体-抗原偶联物发生间接联系，一个ELISA方法的质量是由信号在间接的传递过程中是否和目标分子抗体-抗原偶联物线性相关决定的。相关研究请参阅小编之前的文章ELISA技术应用概览和方法学开发初析。

生物学功能评价和检测分析方法的双重间接性为检测目标的间接性和检测信号传递的间接性。即使最为简单的生物学检测方法，配体受体结合实验在实际的应用过程中由于这两重的间接性导致其方法也变得无比复杂，存在很多的变量，很容易出现假阳性或者假阴性的结果。一个检测方法在方法开发的初期往往需要进行分步的实验来优化方法的可靠性和稳定性，并对建立的方法进行初步的方法学验证。明确需要检测的目标分子，信号和目标分子的关联途径是进行方法学开发，数据解读和问题排查的基础。

ELISA竞争法方法学开发

一般来讲，竞争法实验主要涉及到三个物质，受体，配体和阻断配体受体结合的样品，如PD1受体，PD-L1配体，阻断剂keyturda抗体，也常采用抗原，生物素化抗体，和阻断抗原，生物素化抗体的样品抗体组合。在竞争法开发的初期是建立起受体，配体相互作用的Test system。Test system的条件直接决定了竞争法实验的准确度和测量范围。具体到ELISA竞争法方法开发上，主要包含两个方面：

1.设置多个阴性阳性对照组，确认实验信号值是真实代表目标分子配体受体偶联物。主要考察的是在间接的检测过程中ELISA反应过程采用的酶标板材，酶联抗体和显色液等试剂耗材是否干扰Test system。如下图所示，严格来讲在新建一个ELISA方法时，需要建立一个阳性反应组组5，需要建立多个阴性对照组组1-组4来确认Test system中信号是和目标分子相关。这是一个十分重要，也是十分容易被忽略的问题。除了组5能够得较高的阳性信号，其他分组如果得到较强的阳性信号，整个方法得到的数据都是不可信的。组3和组5（黄色）是ELISA实验常用的对照组，但是组4（蓝色）的缺席会使得整个方法充满分险性，小编多个不同ELISA应用方法学开发的经验表明，很多时候封闭剂起无法达到占据酶标板材空白位置的目的，反应配体或者反应配体中的非特异成分可能会直接吸附在酶标板材上，导致组4出现剂量依赖的假阳性信号。在杂交瘤和噬菌体展示筛选测定时，反应配体溶液的复杂和多样性，使得配体溶液总会存在某些阴性抗体或者克隆能够和酶标板材结合，成分组4的缺席会导致假阳性克隆出现的频率大大增加。设置比较全的阴性对照组也有助于锁定整个体系中哪些试剂发生了交叉反应，找到具体原因，方便更换试剂。 

2.包被受体相对于反应配体的剂量曲线。在确认Test system中阳性信号能够代表目标检测分子后，包被少量的受体，2倍梯度稀释反应配体12-16个点进行全曲线拟合，选取EC80或者EC50的配体浓度作为竞争法反应浓度。如下图所示100ng/ml 受体100ul包被，受体从100000ng/ml 2倍梯度稀释到0.2ng/ml，采用不同稀释浓度的酶联抗体进行检测，整个剂量曲线有明显的上，下平台期，不同的酶联浓度对信号的线性传递未造成明显的影响，酶联抗体起到了等比例将信号放大的作用，EC50为12ng/ml，EC80为40ng/ml。可选取100ng/ml 受体100ul包被，配体的竞争浓度选EC80为40ng/ml，酶联稀释度选择1：600以获得较大的信噪比窗口，增加方法测量范围。在竞争法实验中EC80代表了配体在Test system中占据了受体80%的结合位点，配体和受体在此相对状态下，样品对配体和受体的反应的阻断比较敏感。受体过多，可提供的结合位点较多，样品和受体结合不会影响到配体和受体的结合；配体过多，样品加入后相对于配体较少，竞争不过配体，绝大多数配体依旧和受体结合，在两种情况下样品的加入都无法导致Test system发生明显的变化（配体受体偶联物减少），信号变化不明显。 

建立好完整的Test system后，就是正式建立竞争法的剂量曲线了。主要包含两个方面的内容；

1.将选定EC80浓度的配体和梯度稀释的样品（2倍梯度稀释12-16个点）混匀后加入包被好受体的酶标板材反应，得到有明显上下渐近线的全曲线，如下图所示。 

2.根据实验目的进行，选择样品合适的8个浓度梯度点进行实验，简化实验操作流程，并初步评估方法的质量。具体到应用方面就是亲和力大小比较和定量检测方面。根据笔者的对比研究，发现ELISA竞争法相同条件下的同一个曲线在浓度点细微调整下能够满足两方面的需求，这是笔者开创性的发现，希望业界更多的同行能够进行验证。下文会具体进行两方面应用方法的初步评估。

ELISA竞争法方法学质量的初步验证

当ELISA竞争法开发以亲和力大小比较为目的，往往会以IC50值评价待测样品阻断配体受体结合效果，IC50越小，待测样品的阻断效果越好。亲和力竞争法开发的剂量曲线应该有明显的上下平台期以得到较为稳定的IC50值。生物学活性的方法学验证可参照USP1032, 1033,1034来进行实验方案的设计和数据分析。具体到ELISA竞争法的方法学评价，即制备相对于对照品理论效价为156%，125%，100%，80%，64%的样品进行检测，通过比较对照品和样品的IC50，得到样品相对于实测效价，通过实测效价和理论效价的差异初步确认以亲和力大小比较为目的的ELISA竞争法的质量。承接上文的全曲线选择合适的8个浓度点，进行初步的方法学验证的结果如下图所示：该单次实验如果进行多人和关键试剂的多批次实验，得到的实测效价经过统计学分析将构成方法学验证中最主要的几个概念，精密度，准确度，线性和范围。如结果显示单次实验结果实测效价和理论效价的差异在5%以内，能够初步判断该以亲和力大小比较为目的ELISA竞争法有较好的方法质量。 

当ELISA竞争法开发以定量为目的，选取7个点以理论浓度为X轴，信号值为Y轴进行四参数函数拟合得到标准曲线，将对照品的信号值重新代入标准曲线可得回测浓度值，多次实验统计分析后回测浓度值和理论值的偏差决定了该条标准曲线的检测上限，检测下限，测量范围，更加详尽的方法学验证可参照2015版中国药典第三部9012 生物样品定量分析方法验证指导原则或者美国FDA最新版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation相关论述。如下图所示，对照品在12.5ng/ml-10000ng/ml较大的浓度范围内，回测浓度值和理论浓度的偏差在20%以内，初步能够判断该方法具备较好的质量。需要说明的此定量方法的标准曲线仅仅是将亲和力大小比较的剂量曲线删除了上平台期的最低浓度点。笔者大量的实践表明定量方法的标准曲线明确的平台期点会严重干扰标准曲线的定量准确性。

总结和展望

本文以ELISA竞争法方法学开发和初步方法学验证的案例概论了功能学实验和定量实验的通用原则，包含以下几个步骤：

1. 鉴于生物学方法的双重间接性，明确检测的目标分子，设置多个阳性对照组和阴性对照组，理清信号值和检测目标分子的线性联系；

2. 建立Test system，通过配体受体的结合实验，寻找合适的配体受体相对浓度以得到样品对Test system的敏感性；

3. 加入梯度稀释的样品进入Test system，绘制样品相对于Test system的剂量全曲线；

4. 以实验目的为导向，分别对亲和力大小比较为目的和大分子定量为目的进行差异的浓度点选择，并通过合规的方法学评价程序对方法的质量进行初步的评价。 

ELISA直接法和ELISA竞争法有相同的方法学质量评价程序和标准，即亲和力大小比较的方法学质量评价程序和标准USP1032,1033,1034；定量分析的方法学质量评价程序和标准2015版中国药典第三部9012 生物样品定量分析方法验证指导原则或者美国FDA最新版本的Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation。ELISA竞争法在相同的实验条件下对于对照品浓度点的微调可以完成亲和力大小比较和大分子定量两方面应用，这个有别于笔者之前的文章ELISA技术应用概览和方法学开发初析对于ELISA直接法两方面不同应用不同的实验条件，但是两类方法的四种应用均能够通过验证符合标准要求，只能说实践出真知，不管白猫黑猫，能抓住老鼠的就是好猫了。

在体外所有的体外功能学实验中，样品引起检测体系的变化，并以信号的形式展示出来，这个应该是体外生物学实验方法最通用的原则，有结合才会有功能，功能是对药物引起的变化（响应标志物）的准确定量。理解ELISA实验关于结合和定量的应用以及方法质量评估标准对于所有的功能学实验的开发和评价都有着十分重要的借鉴意义，ELISA里面有乾坤。

2012安进公司的科学家宣称53项癌症著名论文中有47项无法重复，在生命科学研究领域，在追求创新性，第一性的同时，临床前研究结果可重复性差，这个值得我们从业者去反思，也许基础研究领域需要借鉴药物研发企业的一些经验，做好生物功能学方法开发和方法学验证的工作，在得到阳性结果前，先问一句，用来得到此阳性结果的实验方法是否可靠？

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