组织成像能为组织病理诊断提供直观的依据，在医学病理检查中有着重要的地位。传统的医学病理检测通常需要切取一定大小的病变组织，其制作病理切片，最后用显微镜进一步检测病变组织，检测过程耗时较长，并且会为患者带来额外的痛苦。近几十年来，随着光子技术的发展，利用光学手段对疾病进行诊断为临床医学提供了一种新的诊断技术。在众多用于疾病诊断的光子技术中，多光子显微技术（Multiphoton Microscopy, MPM）的发展前景尤为引人注目。多光子显微技术可实现活体的、无创的、实时的、功能可视化成像，不需要造影剂、组织染色或组织处理，具有高灵敏度和亚细胞空间分辨率，使其在疾病诊断中具有很大的应用潜力。

双光子吸收是指在强光激发下，介质分子吸收第一个光子到达虚能级后，在几飞秒内吸收第二个光子，获得足够的能量，从而跃迁到达激发态的过程。在双光子吸收过程中，荧光分子吸收两个能量较低（波长较长）的光子到达激发态，并在跃迁回到基态时产生荧光，可用于荧光成像。自从1990年Denk等人应用双光子吸收的原理开发出第一台双光子激光扫描显微镜^[1]，并应用于生物观测以来，双光子显微镜凭借其优势，使人们可以在活体动物器官上研究细胞和亚细胞水平的功能和形态变化，从而在科研和临床检测中获得了广泛应用。随后，发展出多光子荧光成像技术，MPM是基于飞秒激光与生物组织内在成分相互作用后发生的激发荧光和谐波产生等非线性光学效应的一种新兴的非线性光学成像技术，具有高空间分辨率、低细胞损伤、大成像深度和可应用于组织三维成像等优点。同时，MPM将显微成像技术和光谱测量技术的优点集于一身，可以同时获得组织内在成分的微结构和光谱特性。此外，MPM虽然基于飞秒激光与物质相互作用发生的二次谐波（Second Harmonic Generation, SHG）和双光子激发荧光（Two-Photon Excited Fluorescence, TPEF）等不同物理机制的非线性光学效应，却能在一台非线性光学显微镜中通过简单设置探测器的滤波片而同时获得组织的高对比度SHG和TPEF复合成像。

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与传统单光子显微技术相比，MPM有很大的优势：首先，MPM可以获得组织和器官深层区域的高分辨率图像，成像深度可达1000μm。MPM采用激发波长较长的红外激光，在组织中的散射系数较小，具有很好的组织穿透性，能够探测到更深的组织结构，这种能力对活体成像尤其重要。如果标本被固定和切片，使用传统显微镜可以看到更广泛的组织，但切片中的细胞是死的、不移动的。为了观察细胞在活体样本中移动，需要分析的区域有时位于样本内部深处。在这种情况下，双光子激发显微镜使人能够从表面看到内部，且不需要固定和切片，对生物医学样本进行在体原位的检测。此外，由于双光子激发过程需要更高的瞬时能量，只有激发光焦点处的荧光分子会产生荧光，这减少了组织其他部位的光损伤和荧光分子的光漂白现象，这对长时间的实时成像是有利的。MPM的另一优点是非线性光学效应，如二次谐波的产生。MPM对结缔组织中弹性纤维和胶原结构进行成像，可用于监控疾病进程中胶原纤维的变化，而这些变化在“金标椎”组织病理学上表现不明显。因此，活体多光子显微镜已被用于研究各种器官的生理和病理生理学，如皮肤、呼吸系统、生殖系统、肝、胃肠道、胰腺、肾脏、脾脏、中枢神经系统以及心脏。更重要的是，MPM已运用于肿瘤、皮肤病变等领域，被证明是一种很有前途的深层组织活体成像和临床研究工具^[2]。

（一）自发荧光成像

对生物组织进行双光子荧光显微成像时所使用的荧光可分为两种：自发荧光与外源荧光。然而，应用外源性探针在体内研究人体组织在技术上是困难的，在这种情况下使用内源性荧光信号大大简化了问题。此外，在许多情况下，使用内源性荧光信号不仅可以可视化分子在特定类型的组织中的分布，而且可以研究其中发生的生化过程，尤其是荧光代谢成像已经变得普遍。

自发荧光物质是指生物细胞与组织内固有的荧光物质。当被合适波长的光激发时，一些细胞和组织的内容物能够发出稳定的荧光信号，它们也因此被称为内源荧光团。一些内源荧光团分子广泛分布于细胞和组织之中，例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、色氨酸、卟啉类化合物、黑色素、脂褐素等。这些内源荧光团参与体内重要的生化过程，被广泛应用于医学诊断。

自发荧光成像可为细胞的代谢状态提供重要的信息。在这些自发荧光物质中，以NADH和FAD的应用最为广泛，它们反映了细胞的代谢状态，可为细胞的功能活动、生长活性状态提供灵敏的氧化还原代谢指标^[3]。细胞氧化还原状态是生物能量过程和代谢的决定性因素，与机体的病理过程直接相关，在衰老和疾病状态(如阿尔茨海默氏病、癌症、缺氧和缺血)中都会发生剧烈变化。NAD和NADP是细胞中广泛参与氧化还原过程的辅助因子。氧化和还原的NAD和NADP在细胞的氧化还原状态中发挥重要作用，参与许多关键的代谢过程。NAD参与细胞质糖酵解和线粒体氧化磷酸化并产生ATP，NADP参与脂质、氨基酸、核苷酸的生物合成和抗ROS的保护。因此，ROS的生成依赖于NAD的氧化还原状态，而NADP对细胞起到抗氧化保护作用。NADH的吸收波段范围是330-360 nm，发射波段范围是440-470 nm，NADPH的光谱性质与NADH相似，由于其相似的荧光特性，NADH和NADPH常被统称为NAD(P)H。FAD也是参与氧化还原过程的重要的辅酶，主要位于线粒体。FAD的吸收波段范围是365-465 nm，发射波段范围是520-530 nm。根据氧化的FAD和还原的NADH的荧光强度计算而来的氧化还原比率（redox ratio），是反映细胞能量代谢状态的敏感参数。通常，用FAD/[NAD(P)H+FAD]反映细胞的氧化还原状态。当细胞ATP消耗增加时，氧化磷酸化增加，细胞的氧化还原率升高，偏移向氧化状态；当细胞缺氧时，无氧糖酵解增加，细胞的氧化还原率降低，偏移向还原状态。因此，利用内源性荧光代谢辅助因子的光学成像技术，可以在体内和体外对细胞和组织功能的动态变化进行无损检测，将恶性病变的组织与正常组织区分开来，能为医生提供以前通过其他方法无法实现的诊断见解。

（二）二次谐波成像

二次谐波成像是一种非线性的光学过程，在此过程中，两个相同频率光子与非对称介质发生相互作用，将其从基态激发至虚态。在从虚态恢复到基态的过程中，释放频率增倍、波长减半的光子。由于其可将物质自发激发至虚态的特性，二次谐波成像不需要荧光标记，因此不会受到光漂白或光毒性的影响。

医疗器械展览会Medtec China 2023现场有许多专注于医学成像技术的企业，在生物体中，SHG成像多发生在细胞的非对称结构上，如胶原蛋白、微管蛋白等。生物组织发生病变时一般都会伴随着组织结构、细胞形态及分子结构的变化，SHG对组织微观结构变化高度敏感，因此，SHG成像对于某些疾病（如糖尿病、动脉硬化和一些视网膜疾病等）的早期诊断或术后治疗监测，具有很好的生物医学应用前景。

SHG能特异性显示纤维性胶原沉积情况及三维形态，TPEF可显示组织细胞及间质的形态，两者结合可以完整地显示组织内纤维化的程度及其沉积的部位，可应用于组织及器官的纤维化诊断。与传统病理染色技术相比，基于SHG和TPEF的非线性光学成像技术有以下优势：（1）SHG可区分纤维胶原和非纤维胶原蛋白，可定量测定病理性胶原纤维化的堆积，TPEF可显示细胞结构和成分，将SHG与TPEF结合可得到具有胶原定位和细胞形态信息的组织图像；（2）组织标本无需染色，既可排除染料成分、染色步骤等原因产生的染色差异，又避免受到荧光剂浓度和光漂白效应的影响；（3）该技术还可显示纤维胶原三维结构。例如，肝脏纤维化是大多数慢性肝病的临床过程，其病理学特征是由于反复慢性损伤所导致的肝细胞外胶原纤维过度增生，增生的胶原纤维干扰肝细胞的营养供应，阻碍肝窦血流供应，最终将引起肝细胞坏死、肝硬化等。使用基于SHG和TPEF的非线性光学成像技术对不同阶段的肝硬化标本进行成像，建立全自动肝脏纤维化定量系统，便可对肝脏纤维化进行临床分级，为临床诊断提供新的参考依据。同时，SHG成像也可运用于肿瘤诊断。SHG信号可显示胶原蛋白、弹性蛋白的相关改变及基质分子成分比例变化等生物形态学，这些改变是肿瘤进展过程中的重要标志，因此，SHG提供了另外一种监测疾病的成像模态。

（三）荧光寿命成像

荧光寿命指分子受光脉冲激发后返回基态之前在激发态平均停留的时间，即激发停止后，分子的荧光强度降到激发时最大强度的1/e所需的时间。由于多光子成像需要采用脉冲飞秒激光器，因此特别适合用于提取荧光寿命信号。荧光寿命通常使用时间相关单光子计数(TCSPC)技术来测量，可以达到皮秒级的分辨率。荧光寿命成像（Fluorescence Lifetime Imaging, FLIM）就是将不同荧光寿命进行可视化区别的技术。荧光寿命一般来说是绝对的，不受激发光强度、荧光团浓度和光漂白等因素的影响，而仅与荧光团所处的微环境条件、与蛋白的结合、辅酶的代谢能力等一系列组织生理因素有关。因此，FLIM可以对目标分子所处微环境中的诸多生物物理参数，如氧压、溶液疏水性等及生物化学参数，如pH值、离子浓度等进行定量测量，为组织生理情况的检测（如是否可能患有癌症）提供了可能^[4]。

由于NADH和FAD是许多催化反应中的辅助因子，而且它们的荧光寿命对微环境很敏感，因此，使用TCSPC技术可以分析其涉及的生化过程。蛋白质结合的NADH和游离的FAD分子具有较长的荧光寿命，而游离的NADH和蛋白质结合的FAD分子具有较短的荧光寿命。通过测量游离的和蛋白质结合的NADH和FAD的荧光寿命，可以计算出这些物质的相对数量。癌变组织与正常组织中游离的和蛋白质结合的NADH、FAD含量不一致，因而FLIM技术可以用来区分癌变组织和正常组织，也可区分良性和侵袭性肿瘤细胞^[5]。

（一）肿瘤的诊断

恶性肿瘤一直是人类健康的宿敌。随着社会现代化进程中生活方式和环境的改变，肿瘤的发病率在不断攀升。在相对发达的国家，包括中国，肿瘤已成为危胁生命的主要疾病。肿瘤生物学行为“诡异”、具有很强的异质性：恶性肿瘤起源于人体自身组织，却不受机体控制、侵袭性高、反噬自身。绝大多数肿瘤早期没有征状，明确诊断时往往已届晚期，丧失了治疗机会。外科根治性切除术是目前常见的实体瘤治疗的有效手段，对于选择手术方式、明确手术切除的范围需要一种实时的原位的诊断技术，以了解肿瘤的良恶性、浸润深度、转移情况及切缘有无癌残留等。临床上术前穿刺活检是实体瘤组织学诊断的重要方法，但存在出血、转移、耗时等缺点。目前常用的影像学辅助检查手段如CT、MRI等，均无法判断早期实体瘤的浸润深度及转移情况。因此，急需寻求一种新的原位实时的肿瘤诊断技术。MPM成像不仅可以实时快速地捕获肿瘤的组织学特征，同时还能提供肿瘤代谢水平的信息，无需传统组织病理学活检的繁杂步骤，具备实时、无损、穿透力强、分辨率高等优势，有望成为肿瘤诊断的有力工具。

近年来，已有多项研究将MPM运用于肿瘤领域，以便于提取和量化肿瘤的诊断特征。Zhou等人建立了人体食管癌基质的诊断特征，SHG信号主要来源于胶原纤维，TPEF信号主要来源于弹性纤维（图1）^[6]。正常基质的胶原纤维为精致的、细长的丝状结构，排列紧密有序，而侵入瘤变基质的胶原纤维结构松散、排列紊乱。正常基质的弹性纤维为绳状结构，在组织中分布均匀，而侵入瘤变基质的弹性纤维更短、更碎，有聚集在一起的趋势。由此可见，成像中形态学的特异性改变为上皮癌前病变提供了诊断依据。

图 1 正常人体食管基质与癌变基质的SHG图像、TPEF图像、SHG/TPEF复合图像^[6]

恶性肿瘤的发生发展是一个多阶段过程，包括正常阶段、非侵入瘤变阶段、侵入瘤变阶段。如果能在侵入瘤变前的阶段诊出，那么肿瘤的治愈率会大大提高。换言之，如果能监测肿瘤的发展进程，便有助于改善肿瘤的早期诊断和治疗。癌细胞出现的最低侵袭部位能反应肿瘤浸润深度。使用MPM分别对人体的正常组织、原位癌、浸润癌进行原位实时的微结构成像，以癌细胞的出现来判断肿瘤的浸润深度，使得诊断不同时期的肿瘤成为了可能。Yan等通过对突破浆膜层和未突破浆膜层胃癌进行多光子实时成像，显示浸润浆膜的胃癌胶原结构极不规则、胶原成分显著减少、癌细胞浸润、胞核多形性及不规则腺管样结构，与HE染色的诊断结果一致（图2）^[7]。该研究证实了MPM用于实时诊断突破浆膜层胃癌的特异性、准确性和可行性。另外，基底膜的改变是肿瘤发展进程的最重要指标之一，包括基底膜尺寸和密度的变化、基底膜的丢失等。然而目前，这些先兆症状仅能由组织病理活检探测得到。因此，发展可用于探测这些先兆症状的无损、原位的新光学成像技术具有重大的医学意义。SHG成像技术能很好地显示基底膜的轮廓，从而判断癌细胞的侵袭程度。在正常上皮组织中，基底膜形态规则；在非侵入瘤变组织中，基底膜尺寸变大、数量减少、形态改变；在侵入瘤变上皮中，基底膜已完全消失。

图 2 突破浆膜层和未突破浆膜层胃癌的多光子成像和HE染色成像^[7]

除了比较细胞形态学的差异，MPM同时也能分析细胞的氧化还原率，以此来研究肿瘤的代谢特征和异质性。对肿瘤细胞进行代谢成像表明，这些细胞的氧化还原率降低，平均荧光寿命降低。这些结果与肿瘤细胞的Warburg效应有关，即与正常的细胞相比，肿瘤细胞即使在氧供充足的情况下，也会优先进行糖酵解。这是因为肿瘤细胞需要大量进行增殖，糖酵解途径为合成增殖所需的生物大分子提供了前体。一般情况下，与正常细胞相比，癌细胞有更低的氧化还原率和更短的NADH荧光寿命，而当癌细胞接受抗癌药物治疗时则观察到相反的趋势。这是由于糖酵解过程中NADH会积累，而氧化磷酸化过程中，NADH在线粒体中被氧化成NAD+，FAD的变化正好相反，因此，癌细胞的氧化还原率会降低。游离的NADH主要定位在胞浆中并参与糖酵解，而蛋白结合的NADH参与线粒体的氧化磷酸化，且游离的NADH荧光寿命短，因此观察到癌细胞有短的NADH荧光寿命。氧化还原率和游离型和结合型NADH的浓度比值可用于检测癌前细胞，区分不同增殖程度的细胞，研究不同细胞系的反应和耐药特性。尤其是在早期治疗阶段，代谢成像可以表征细胞对药物的反应，将来可能用于个性化医疗。

（二）皮肤疾病的诊断

德国JenLab公司已经实现了多光子皮肤检测技术的产业化。其产品使用近红外飞秒激光脉冲对皮肤组织进行照射，可得到自发荧光、SHG、CARS的3种成像信号，形成对皮肤组织结构成分的图像；同时，利用荧光寿命成像技术能够得到皮肤组织的微环境信息，以分析活体组织的生理、病理性状况。由于双光子技术具有很好的共聚焦效应，且长波长光具有较小的吸收和散射系数，这一系统能够得到深度范围较大(能够达到几百微米级别)的光学层析成像，因此能够无创地检测皮肤组织各个层次的结构与生理情况。

多光子显微镜在皮肤衰老检测、炎性皮肤病及皮肤癌诊断等方面均发挥着一定的作用。虽然人们已经普遍认为紫外光照射是造成皮肤光老化的主要原因，在临床上，仍然缺乏一种能直接、无标记地评价皮肤光老化程度的实时诊断工具。在人体皮肤衰老的过程中，真皮层中的胶原蛋白纤维与弹性蛋白纤维的形态、网络结构会发生改变。同时，胶原蛋白纤维与弹性蛋白纤维的分布也会发生改变。利用非线性光学信号可以评估皮肤光老化程度，SHG信号由胶原蛋白纤维产生，TPEF信号由弹性蛋白纤维产生。对20、40、70岁三个年龄段的人的皮肤进行多光子成像，产生SHG信号的胶原纤维在20岁时最多，产生TPEF信号的弹性纤维在70岁时最多（图3）^[8]。除了定性检测以外，数字化的指标也可以用来量化皮肤光老化程度。SHG-TPEF老化指数定义为SAAID，即（SHG-TPEF）/（SHG+TPEF），SHG和TPEF分别代表SHG信号和TPEF信号的像素数。根据这一定义，年龄越长者，因为皮肤组织的弹性纤维多于胶原纤维，SAAID相应的负值就会越大。由此可见，MPM能直接在体聚焦皮肤真皮层的胶原纤维和弹性纤维，有效定量皮肤光老化程度。

图 3 不同年龄人皮肤真皮层SHG/TPEF图像^[8]

基底皮肤癌（BCC）是一种常见的皮肤恶性肿瘤，在真皮内聚集成结节状。临床上，外科医生依靠一系列先进技术，比如Mohs显微手术方式，对BCC实施切除、诊断再切除。若有一种能直接实时监测肿瘤边缘的诊断方法，既能节省时间又能减少组织切除面积。MPM成像可以清楚的区分正常组织和肿瘤组织，密集的癌细胞聚集在一起形成结节状BCC肿瘤。同时，肿瘤区域与正常区域的SAAID值也有所差异^[9]。通过监测内源性NADH的荧光变化，可以对人表皮细胞的线粒体动态变化进行成像。在健康皮肤中，随着深度的增加，细胞内线粒体的分布会逐渐发生变化，而在肿瘤组织中则不存在这种趋势，利用这一差异，可以对健康组织和癌组织进行无创诊断^[10]。

多光子显微技术是一种高效、灵敏、无损伤的用于临床前和临床研究的成像工具，允许在原位定性和定量获取组织不同层次的微观结构和代谢特征，在疾病诊断中具有很大发展潜力，尤其是在肿瘤诊断和皮肤疾病诊断领域得到广泛应用。多光子成像技术无需传统病理活检的组织切取、固定、染色等步骤，是一种实时快速且无创的“光学活检”诊断方法。多光子成像可以实时了解病变的组织结构和细胞形态，快速诊断肿瘤、判断手术切缘有无癌残留，可在不损标本的情况下进行“光学活检”。同时，多光子成像还能动态监测病变组织的代谢情况，而这是别的诊断技术无法实现的。

随着显微内镜小型化和微型化的发展，已有微型化双光子和双光子光纤内窥镜。MPM朝微型化方向发展具有良好的应用前景。在多光子成像技术设备创新上，可把多光子显微镜和多光子探头结合，或多光子成像系统与内窥镜整合，实现多光子显微内镜的推广使用，不仅实现多光子成像，还可实现多光子摄像。这将是十分可观的发展前景，很大程度上能改进临床的诊疗过程，实现真正意义上的“活检”。

总而言之，多光子成像技术作为一种新兴的光学活检方法，在医学诊断中有很好的应用前景，随着其在临床研究中的应用越来越多，未来必将在疾病诊断中发挥重要作用。多光子成像技术朝微型化发展的趋势势不可挡，研发多光子内窥镜、多光子探头等将促进转化医学的发展，为生物成像与相关临床诊断领域带来一场强有力的革命。

文章来源：超维景科研解决方案